Question

【题目】苎麻纤维被普遍应用于纺织和造纸行业,但其中含有的胶质必须被去除；与传统的高温碱煮相比，芽孢杆菌产生的碱性果胶酶用于苎麻脱胶具有降低能耗和化学污染的优势，因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌，低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义。请回答下列问题：

（1）芽孢杆菌在产生碱性果胶酶的同时会分泌出对纤维有害的内源性纤维素酶，因此将碱性果胶酶基因pel转入毕赤酵母中表达，该过程需要_________________（工具酶）和载体，作为载体必须具备能够在宿主细胞内复制并稳定保存，以及______________(至少答出两点)等条件。

（2）构建的基因表达载体应含有毕赤酵母的启动子作为_____________酶识别和结合的部位，从而启动目的基因的表达；同时还应含有标记基因，其作用是___________________。

（3）将基因表达载体导入毕赤酵母时，应采用_______________________处理，使其处于________________________________。

（4）目的基因在受体细胞是否能翻译出蛋白质，可用______________技术来检测。也可将导入目的基因的毕赤酵母接种于果胶底物平板上28℃培养， 2–3 d 后观察结果如下图（A为刚接种时，B为培养2–3d后），水解圈越大代表___________________________。

Answer 1

【答案】 限制酶和DNA连接酶 具有特定的限制酶切割位点、具有某些标记基因 RNA聚合 将含有基因表达载体的毕赤酵母筛选出来 钙离子（Ca2＋） 感受态 抗原-抗体杂交 对应菌株产酶能力越强（或“对应菌株产酶数量越多”）

【解析】本题以碱性果胶酶高产菌株的构建为背景，综合考查学生对DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序等相关知识的识记和理解能力。

(1) 将碱性果胶酶基因pel（目的基因）转入毕赤酵母（受体细胞）中表达，该过程需要构建基因表达载体，此时需要限制酶和DNA连接酶作为工具酶。作为载体必须具备的条件是：一是在宿主细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制，即能在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因；二是具有特定的（或一个至多个）限制酶切点，以供外源DNA片段（目的基因）插入其中；三是具有某些标记基因，以便供重组DNA的鉴定和选择。

(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，标记基因的作用是将含有基因表达载体的毕赤酵母（受体细胞）筛选出来。

(3) 毕赤酵母属于单细胞的微生物；将基因表达载体导入毕赤酵母时，应采用钙离子（Ca2＋）处理毕赤酵母，使其处于感受态。

(4) 目的基因在受体细胞是否能翻译出蛋白质，可用抗原-抗体杂交技术来检测。导入目的基因的毕赤酵母产生的碱性果胶酶能水解平板上的果胶，形成水解圈；水解圈越大，代表对应菌株产酶能力越强（或“对应菌株产酶数量越多”）。