Question

【题目】许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如下图所示。请据图回答：

(1)基因工程中，能使目的基因在受体细胞中特异性表达的调控序列是_______ 。

(2)限制酶EcoR Ⅰ的识别序列和切割位点是－G↓AATTC－，Sma Ⅰ的识别序列和切割位点是－CCC↓GGG－。图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是__________，连接过程中需要的基本工具是__________。

(3)转化过程中，大肠杆菌应先用________处理，使其处于能吸收周围DNA的状态。

(4)菌落颜色为白色的是________，原因是_______________________。

(5)菌落③中的目的基因是否表达，可采用的检测办法是_________________。

Answer 1

【答案】 启动子 －TTAA DNA连接酶 Ca2＋ 菌落③ lacZ标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出β－半乳糖苷酶，故菌落为白色 抗原—抗体杂交

【解析】本题主要考查基因工程的操作步骤。难点在于限制酶的选择及目的基因的处理。要求学生能熟知基因工程的操作步骤，会分析限制酶作用后的粘性末端。

（1）启动子是一段有特殊序列的DNA片段，位于目的基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，在启动子存在时才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。因此在基因工程中，能使目的基因在受体细胞中特异性表达的调控序列是启动子。

（2）由图可知，目的基因的左侧有限制酶EcoRI的识别序列，右侧是限制酶Sma I的识别序列，而质粒上只有限制酶EcoRI的识别序列，所以需要用限制酶EcoRI来切割质粒，用限制酶EcoRI和Sma I来切割含有目的基因的外源DNA分子，这样就使目的基因右侧无法与质粒连接，所以目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，连接过程中需要DNA连接酶。

（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞之前，应先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围DNA的感受态。

（4）用限制酶EcoRI切割质粒时，会破坏质粒上的lacZ'基因，但切割后的质粒自身环化后，lacZ'基因又被修复，能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，所以菌落①②呈现蓝色；菌落③导入的是重组质粒，其lacZ'基因被破坏，不能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落颜色为白色。

（5）检测目的基因是否表达产生蛋白质，可采用抗原一抗体杂交法。