Question

【题目】金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过___________获得___________用于PCR扩增。

（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的___________位点。设计引物时需要避免引物之间形成___________，而造成引物自连。

（3）图中步骤1代表高温变性，可以使双链___________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏___________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但___________的引物需要设定更高的退火温度。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物）。

Answer 1

【答案】逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 解旋 引物与模板 GC含量高 ②③

【解析】

PCR技术是多聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。用PCR技术扩增目的基因，要先制备目的基因作为模板。

（1）用mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的过程是逆转录的过程。

（2）构建重组质粒时，需要先对目的基因和质粒进行切割，因此在引物中需要增加适当的限制酶切点，便于切割和连接。设计的引物之间不能碱基互补配对，否则引物自连后，无法与模板连接。

（3）步骤1是高温变性，使模板DNA双链氢键打开而解旋。

（4）退火的目的是使引物结合到互补DNA链上，因此退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。G-C之间有3个氢键，A-T之间2个氢键，氢键越多结构越稳定，因此对于GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。

（5）根据上述题的分析，如果PCR反应得不到任何扩增产物，有可能是引物间自连，也可能是退火温度过高造成的，因此要采取②降低退火温度③重新设计引物的改进措施。