Question

【题目】为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先合成两条引物，并获得细菌的_______________________。

(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____________________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的_________________________。

(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）

①加热至90～95℃(变性)

②冷却至55～60℃(复性)

③加热至70～75℃(延伸)

④90～95℃维持时间

⑤55～60℃维持时间

⑥70～75℃维持时间

(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。

(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

缓冲液	50 mmol/LNa2HPO4-KH2PO4				50 mmol/LGly-NaOH				50 mmol/LTris-HCl
pH	6.0	6.5	7.0	7.5	7.5	8.0	8.5	9.0		9.0	9.5	10.0	10.5
酶相对活性%	25.4	40.2	49.8	63.2	70.1	99.5	95.5	85.3		68.1	63.7	41.5	20.8

根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为___________________________

Answer 1

【答案】基因组DNA 5’ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 ② ⑥ 7 16 pH为8.0，缓冲液为50 mmol/LGly-NaOH

【解析】

PCR的原理是DNA双链的复制，原料是四种游离的脱氧核苷酸，需要2种引物，需要耐高温的DNA聚合酶。PCR包括：高温变性；降温复性；延伸子链。

（1）由题干信息可知，海洋生物含有α-淀粉酶基因，因此要首先获得细菌的基因组DNA，从中提取并扩增目的基因。

（2）引物可以引导子链的延伸，脱氧核苷酸是与引物的3’端相连的，故要在引物的5’端假说限制酶切点。常在2条引物上加入不同的限制酶切点，目的是使DNA片段能定向插入基因表达载体，防止自身相连。

（3）PCR扩增时，②退火的温度与引物长短和碱基种类有关。⑥70～75℃维持时间即延伸时间长短与扩增片段的长度有关。

（4）图中含有7个密码子：AUG、CCA、UCA、ACA、AAU、ACU、AAG。虚线框后密码子的第一位碱基是G，第二位有4种可能性，第三位有4种可能性，故密码子种类是4×4=16种。

（5）由图表可知，pH为8.0，缓冲液为50 mmol/LGly-NaOH中酶活性最高，为99.5。