Question

【题目】海洋石油污染正引起光泛关注。利用基因工程菌进行生物降解具有巨大的应用潜力。P450是石油降解的关键酶，用Sal I和NdeI联合酶切获得的P450基因，与甲图所示的质粒pCom8重组，导入土著石油降解菌种Y9，获得了基因工程菌中mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的菌落变成黑色，aacCl是庆大霉素（一种抗生素）抗性基因，限制酶NdeI、XhoI和SspI在原质粒上均只有一个酶切位点，数字表示酶切位点间的碱基对数，乙图表示几种限制酶的识别序列和切割位点。

(1)构建重组质粒时，需要使用限制酶和_____酶。图乙所示的几种限制酶中，切割目的基因产生平末端的是_______。

(2)质粒pCom8需用限制酶_____作用后，才能与P450基因形成重组质粒：为了便于重组质粒的导入，常使用_____处理Y9细胞，使其成为感受态细胞。若对重组质粒再次使用上述限制酶切制，可获得_____个DNA片段。

(3)经测定原质粒为7.6kb(1kb为1000个碱基对)，重组质粒经NdeI.SspI联合酶切后获得了6.0kb和1.2kb的两个片段，则目的基因的长度为______kb。

(4)由于重组质粒导入受体细胞的成功率很低，所以需要经过筛选才能获得工程菌。操作的大致思路是：

第一步，配制培养基。除下表中的成分外，还必须添加琼脂和_____。

蛋白胨	酵母侵膏	NaCl	KCl	MgCl2	H2O	pH
20g	5.0g	0.5g	0.2g	1.0g	1000ml	7.0

第二步，将待检菌液接种在第一步配制的培养基上。

第三步，选择_____色菌落扩大培养即可获得所需的工程菌。

Answer 1

【答案】DNA连接(酶) SspI Nde1、XhoI Ca2＋ I 1.4 庆大霉素 白

【解析】

据图分析，图示为质粒和相关限制酶的识别和切割位点，甲图质粒中有限制酶NdeⅠ、XhoⅠ和SspⅠ的切割位点，且NdeⅠ与另外两种限制酶之间的碱基对数分别为1.8kb、1.2kb；从图中能看出SspⅠ破坏了标记基因aacCl。

（1）构建重组质粒时，需要使用限制酶将质粒和目的基因切出相同的黏性末端并用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起。由图可知，图乙所示的几种限制酶中，切割目的基因产生平末端的是SspI。

（2）根据题干信息已知，切割P450基因的限制酶是SalI和NdeI联合酶，而甲图质粒上没有SalⅠ酶的酶切位点，所以切割质粒时可用乙图中的XhoI酶代替，二者作用后可形成相同的黏性末端。所以质粒pCom8需用限制酶Nde1、XhoI作用后，再与目的基因在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。为了便于重组质粒的导入，常使用Ca2＋处理Y9细胞，使其成为感受态细胞。若对重组质粒再次使用上述限制酶切制，由于只有NdeI酶可识别其切割位点，所以可获得1个线性DNA片段。

（3）据图分析，用NdeⅠ、XhoⅠ切割质粒后质粒的长度部位7.6-1.8=5.8kb，而重组质粒长度=6.0+1.2=7.2kb，因此目的基因的长度=7.2-5.8=1.4kb。

（4）重组质粒导入受体细胞的成功率很低，大多数质粒是空白质粒，没有目的基因，因此需要经过筛选才能获得工程菌：第一步，配制培养基，表格中的成分有碳源、氮源、水和无机盐，由于重组质粒上含有标记基因，且选择培养基是固体培养基，因此培养基中还必须添加琼脂和庆大霉素。
第二步，将待检菌液用稀释涂布平板法接种在第一步配制的培养基上。
第三步，甲图中mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的菌落变成黑色，而该基因已经被限制酶切割和破坏了，因此应该选择白色菌落扩大培养即可获得所需的工程菌。