Question

【题目】钙依赖蛋白激酶（CDPK）在植物的信号传导和提高植物抗性方面发挥着重要作用，科学家通过将CDPK基因导入拟南芥中，来获得具有抗性的新品种。下图为某种质粒表达载体和含CDPK基因的DNA片段示意图，图中标记了限制酶的切割位点。回答下列问题：

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括___________________________。为了使CDPK基因插入质粒中，应选取________________两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。

（2）将获取的CDPK基因进行PCR扩增，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________。

（3）图中所示的质粒为Ti质粒，操作过程中需要把CDFK基因插入到质粒的T-DNA片段中，T-DNA片段在转化中的作用是______________________________________________。为了检测CDPK基因是否导入成功，可以用________________________________作探针检测CDPK基因是否导入拟南芥细胞，导入成功的标志是_________________________ 。

（4）为研究CDPK基因表达载体对拟南芥的遗传转化的影响，将转化后的拟南芥植株生长成熟后，采集其种子，播种于含________________________的MS培养基中进行抗性筛选。

Answer 1

【答案】基因组文库和cDNA文库 Xbal和Small Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 T-DNA片段能携带CDPK基因整合到受体细胞的染色体DNA上 放射性同位素标记的含有CDPK基因的DNA片段 显示出杂交带 卡那霉素

【解析】

分析题图：CDPK基因为目的基因，卡那霉素抗性基因为标记基因。质粒上和含CDPK基因的DNA片段中含有的酶切位点相同，其中EcoRⅠ的识别位点位于质粒上的卡那霉素抗性基因的内部，HindIII的识别位点位于CDPK基因的内部。CDPK基因的左侧有SmaⅠ与EcoRⅠ的识别位点，右侧有Xbal I的识别位点。

(1) 基因文库包括基因组文库和cDNA文库。分析题图可知：质粒上和含CDPK基因的DNA片段中含有的酶切位点相同。CDPK基因为目的基因，卡那霉素抗性基因为标记基因。若使用EcoRⅠ切割，则会破坏质粒中的卡那霉素抗性基因；若使用HindIII切割，则会破坏CDPK基因。CDPK基因的两端分别含有Xbal和SmalI的识别位点，若用Xbal和SmalI切割含CDPK基因的DNA片段和质粒，则能保持CDPK基因和卡那霉素抗性基因结构的完整性。所以为了使CDPK基因插入质粒中，应选取Xbal和Small两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段。

(2) 利用PCR技术扩增CDPK基因（目的基因）的过程是在较高温度下进行的，Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活，所以目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。

(3) 质粒的T-DNA片段在转化中的作用是：T-DNA片段能携带CDPK基因整合到受体细胞的染色体DNA上。检测CDPK基因是否导入成功，应采用DNA分子杂交技术，在该技术中，需用放射性同位素标记的含有CDPK基因的DNA片段作探针。如果显示出杂交带，则标志着导入成功。

(4) 因此项基因工程中的标记基因为卡那霉素抗性基因，所以应将转化后的拟南芥植株生长成熟后，采集其种子，播种于含卡那霉素的MS培养基中进行抗性筛选。