Question

【题目】回答下列有关现代生物技术的问题。

哺乳动物细胞产生的酶M在工业上极具应用价值，现拟利用大肠杆菌大规模生产该酶。哺乳动物DNA片段如图1所示，用作运载体的质粒pXY6如图2所示，VanR表示万古霉素抗性基因，GFP基因则编码绿色荧光蛋白，大肠杆菌不具有这两种基因。相关限制酶的所有酶切位点均已于图上标注，识别序列见表。

NsiI	PstI	SbfI	BclI	BspEI
ATGCA↓T T↑ACGTA	CTGCA↓G G↑ACGTC	CCTGCA↓GG GG↑ACGTCC	T↓GATCA ACTAG↑T	T↓CCGGA AGGCC↑T

（重组质粒的构建及分析）

（1）现要在只使用一种限制酶的情况下，从哺乳动物DNA中切下酶M基因，并切开质粒pXY6，连接二者获得重组质粒pXY7，则应选择的限制酶是___________。

（2）若用BspE1和SbfI联合酶切质粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb两种长度的片段。若用BspE1单独酶切若干份质粒pXY7，则有两种不同的酶切结果：其中一种结果得1.7kb和3.1kb两种长度的片段，则另一种结果得___________kb和___________kb两种长度的片段。

（工程菌的筛选及产品加工）

（3）被成功导入pXY7质粒的工程菌应具备的特点是___________

A．具万古霉素抗性，发绿色荧光 B．具万古霉素抗性，不发绿色荧光

C．不具万古霉素抗性，发绿色荧光 D．不具万古霉素抗性，不发绿色荧光

（4）对工程菌生产出的酶M进行分离纯化的步骤是（用数字编号填空）：

破碎细胞→过滤获滤液→___________→___________→___________→酶制剂

①通过层析提纯酶蛋白 ②通过冷冻干燥结晶酶蛋白 ③改变pH或加入硫酸铵使酶蛋白沉淀

（5）上述工艺流程涉及的生物工程领域包括___________（多选）

A．发酵工程 B．基因工程 C．细胞工程 D．酶工程

Answer 1

【答案】PstI 2.7 2.1 B ③ ① ② BD

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取：（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。

2、基因表达载体的构建:（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

3、将目的基因导入受体细胞:（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

4、目的基因的检测和表达：（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

（1）现要在只使用一种限制酶的情况下，从哺乳动物DNA中切下酶M基因，并切开质粒pXY6，连接二者获得重组质粒pXY7，所选的限制酶应该在目的基因和质粒上都有识别及切割位点，结合图1、图2及表格信息判断，可以选择限制酶PstI。

（2）若用BspE1和SbfI联合酶切质粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb两种长度的片段。说明上边BspE1和SbfI之间为1.2kb，下边为2.1kb，若用BspE1单独酶切若干份质粒pXY7，另一种结果得1.2+1.5＝2.7kb和2.1kb。

（3）被成功导入pXY7质粒的工程菌万古霉素抗性基因，不含GFP基因，所以工程菌具万古霉素抗性，不发绿色荧光的特点，故选B。

（4）通过加入硫酸铵的方式让蛋白质沉淀，通过层析的方式对蛋白进行提纯，通过冷冻干燥结晶酶蛋白，故顺序是③①②。

（5）上述工艺流程涉及的生物工程领域包括基因工程和酶工程，故选BD。