Question

【题目】图示pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶SacⅠ、 SphⅠ， BglⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题。

表1

	pIJ702	pZHZ8
BglⅡ	5．7kb	6．7kb

表2

固体培养基中硫链丝菌素浓度（μg/mL）	0	1	2	5	10
不含质粒的链霉菌生长状况	+++++	+++	+	-	-

“+”表示生长；“-”表示不生长。

（1）限制性内切核酸酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间_______的断裂，切割形成的末端有_______两种。

（2）以SacⅠ和SphⅠ切取的目的基因置换质粒PIJ702上长度为0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为_____kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是____________________________。

（3）导入目的基因时，首先用______处理链霉菌使其成为感受态细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于________中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成______过程。

（4）不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pzHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在______μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是________________________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯键 黏性末端和平末端 1．4 pIJ702上的原有BglⅡ位点被目的基因置换得到的环状pZH28，仍能被BglⅡ切割成一条线段 Ca2+ 缓冲液 转化 5 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选

【解析】

该题主要考察了基因工程的相关操作，基因工程的基本操作步骤为目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入到受体细胞、目的基因的检测与鉴定。限制性核酸内切酶主要作用于识别序列的磷酸二酯键，切割完以后可能会产生黏性末端或者是平末端。将目的基因导入受体细胞时，常常使用Ca2+使得受体细胞成为感受态细胞。

（1）限制性内切核酸酶是作用于其所识别序列中剪切位点的磷酸二酯键，不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏性末端和平末端；

（2）由题干可知，质粒PIJ702上具有长度为0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，使用SacⅠ和SphⅠ切取质粒会多置换下0.4kb的片段，而BglⅡ在原质粒和重组质粒上的切割片段相差1.0kb，介于BglⅡ的识别位点位于SacⅠ和SphⅠ之间，所以推测目的基因的片段长度应该为1.0+0.4=1.4kb；在表格中可以反应出重组质粒可以被BglⅡ限制酶切割，切割后称为一条线段，但原有质粒上的相关片段已经被SacⅠ和SphⅠ置换为目的基因，因此推测目的基因中也含有1个BglⅡ切割位点；

（3）将目的基因导入到受体细胞之前，需要将受体细胞用Ca2+处理使得受体细胞成为感受态细胞；然后重组质粒要溶解到缓冲液中与感受态细胞融合；从而促进链霉菌完成转化的过程；

（4）根据图中的表格可知，要想对重组的链霉菌细胞进行筛选，应该满足不含质粒的链霉菌无法生长的要求，因此所需硫链丝菌素浓度至少应在5μg/mL以上；在该质粒上存在一个mel基因，其表达的产物会使得白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，所以导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色，而重组质粒pZHZ8在构建的时候破坏了mel基因，所以该重组质粒导入到链霉菌后菌落呈白色，后通过观察菌落的颜色进行挑选。