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    6．目前所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示．
    （1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）．
    （2）pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR 1只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割．若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端．
    （3）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复磷酸二酯键 键，成功的获得了重组质粒．
    （4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落．再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）．与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒．

    分析 分析题图：菌落能在含有氨苄青霉素的培养基生存，说明了菌落含有抗氨苄青霉素基因；将沾上菌落绒布按到含四环素的培养基上培养，仍能生长，说明了菌落也含有抗四环素基因，不能生长的则不含抗四环素基因．

    解答 解：（1）质粒上的抗性基因可作标记基因，便于鉴定受体细胞中是否导入目的基因．
    （2）在目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，即目的基因两侧有-GAATTC-，目的基因两侧被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端为．
    （3）DNA连接酶能连接磷酸二酯键．
    （4）图二中的菌落能抗氨苄青霉素，将灭菌绒布按到图二中培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到图三含四环素的培养基上培养，仍能生长的也能抗四环素，空圈为不能抗四环素的（只能抗氨苄青霉素）．图三结果显示，多数大肠杆菌既能抗氨苄青霉素，又能抗四环素，说明导入的是pBR322质粒，而不是重组质粒（重组质粒的四环素抗性基因被切断，不能表达，因此含重组质粒的大肠杆菌抗氨苄青霉素）．
    故答案为：
    （1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）
    （2）

    （3）磷酸二酯键
    （4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素     pBR322质粒

    点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握基因工程各操作步骤中需要注意的细节，能结合图中信息准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查．

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