Question

【题目】CRISPR/Cas9系统是由Cas9蛋白（一种核酸酶）和sgRNA（向导RNA）构成的RNA-蛋白复合体，可利用sgRNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目的基因进行编辑（如图所示）。RuBisCo是参与光合作用的关键酶，研究人员拟利用CRISPR/Cas9技术对大豆细胞RuBisCo基因进行定点编辑，以达到提高CO2利用率的目的，回答下列问题：

（1）利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，Cas9蛋白可催化_______________（化学键名称）水解，剪切特定DNA片段，因此Cas9蛋白的这一功能与_______________酶相似。

（2）用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中sgRNA碱基序列不同，因此首先要确定RuBisCo基因中的待编辑序列，根据_______________原则设计引物，通过_______________技术扩增相应的基因序列，作为编码特定sgRNA的模板。该技术所需的Taq酶特点是_______________，能使整个反应体系中DNA解链、退火、链的延伸都能快速进行。

（3）将扩增获得的DNA片段与_______________基因共同导入到质粒载体，构建CRISPR/Cas9表达载体，将构建成功的表达载体通过_______________方法，导入大豆细胞。若检测到受体细胞中组成RuBisCo酶的氨基酸_______________发生了符合预期的改变，则表明基因编辑成功。

（4）CRISPR/Cas9系统在定点编辑基因时仍存在一个最大的弊端，就是有很大概率会造成其他一些非目的基因序列的错误剪接和编辑，请尝试分析其原因_______________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯键 限制/限制性核酸内切 碱基互补配对 PCR 耐高温 Cas9（蛋白） 农杆菌转化/农杆菌 种类、数目、排列顺序 其他基因序列也可能含有能与SgRNA互补配对的序列，造成SgRNA和Cas9的错误结合并且剪切

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：

分子水平上的检测：

①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；

②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）Cas9蛋白能剪切特定DNA片段，这与限制酶的功能相似，可催化DNA中磷酸二酯键水解。

（2）要确定RuBisCo基因中的待编辑序列，可根据碱基互补配对原则设计引物，通过 PCR技术扩增相应的基因序列，作为编码特定sgRNA的模板。该技术所需的Taq酶能耐高温，使整个反应体系中DNA解链、退火、链的延伸都能快速进行。

（3）要构建CRISPR/Cas9表达载体，需要将扩增获得的DNA片段与Cas9蛋白基因共同导入到质粒载体，将表达载体导入植物细胞通常采用农杆菌转化法。若检测到受体细胞中组成RuBisCo酶的氨基酸种类、数目、排列顺序发生了符合预期的改变，则表明基因编辑成功。

（4）因其他基因序列也可能含有能与SgRNA互补配对的序列，造成SgRNA和Cas9的错误结合并且剪切，这会导致CRISPR/Cas9系统在定点编辑基因时有很大概率会造成其他一些非目的基因序列的错误剪接和编辑。