Question

【题目】I．新一代基因编辑工具由 Cas9（一种限制性核酸内切酶）和向导RNA构成。该复合体能与DNA分子上的特定序列结合，并在合适位点切断DNA双链（如下图所示）。DNA被切断后，细胞会启动DNA损伤修复机制，在此基础上如果为细胞提供一个修复模板，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，从而实现基因编辑。请回答：

（1）在将编码Cas9的基因导入真核细胞的转基因操作中，若控制合成Cas9的基因序列已知，可用_______方法合成目的基因，再构建表达载体导入真核细胞。上述转基因操作成功的标志________________。

（2）如图1所示，基因编辑工具发挥作用时，向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为碱基互补序列所以能结合在一起，然后由Cas9催化__________键断裂，从而使 DNA分子断裂。

（3）一般来说，在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和_____（填“相同”或“不同”）的向导RNA进行基因的相关编辑。

（4）如图2所示，若用两种识别切割序列完全不同的限制酶E和F从基因组DNA上切下目的基因，并将之取代质粒pZHZ1(3.7kb，1kb=1000对碱基)上相应的E—F区域(0.2kb)。已知在质粒pZHZl中，限制酶G切割位点距限制酶E切割位点0．8kb，限制酶H切割位点距限制酶F切割位点O．5kb。若分别用限制酶G和H酶切两份重组质粒pZHZ2样品，据表所列为酶切结果。请将目的基因内部的限制酶G和H切割位点标注在图3中。_______

Ⅱ．青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，其中发育性青光眼（婴幼儿型和青少年型）具有明显的家族遗传倾向。检查发现，发育型青光眼患者角膜小梁细胞中M蛋白异常。为研究其病因，研究者用含绿色荧光蛋白基因G或红色荧光蛋白基因R的质粒、正常人M蛋白基因（M+）或青光眼患者M蛋白基因（M-），构建基因表达载体，分别导入Hela细胞中进行培养，一段时间后检测培养液和细胞中荧光的分布情况，实验分组及检测结果如下表（示只含荧光蛋白基因的质粒片段；示含荧光蛋白基因和M蛋白基因的质粒片段，此时两基因表达的产物是一个整体）。

（1） 据下表推测，发育型青光眼的病因是_______异常导致其指导合成的M蛋白异常，导致小梁细胞中的M蛋白___________________，而在细胞中大量积累，最终导致小梁细胞功能异常。

（2）下表中第___________组实验可以判断：发育型青光眼是显性遗传病。

Answer 1

【答案】化学 控制Cas9基因的成功表达 磷酸二酯 不同 M蛋白基因 不能正常地分泌到细胞外 4组、5组、6组

【解析】

（1）获得目的基因的方法：①从基因文库中获取；②利用PCR技术扩增；③人工合成(化学合成)。原核生物的基因采取直接分离获得，真核生物的基因一般是人工合成。

（2）DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶、运载体。

（3）目的基因的检测与鉴定，常用基因探针--用放射性同位素(或荧光分子)标记的含有目的基因DNA片段。

Ⅰ、分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因常用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA常用分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原-抗体杂交技术。

Ⅱ、个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

I．（1）对于基因序列已知的目的基因可以通过DNA合成仪用化学法直接人工合成。转基因成功的标志是合成目的基因的产物，本题中应为控制Cas9基因的成功表达。

（2）Cas9是一种限制性核酸内切酶，催化脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键水解，从而使 DNA分子断裂。

（3）如图所示，基因编辑工具发挥作用时，向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为碱基序列互补所以能结合在一起，所以在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的向导RNA进行基因的相关编辑。

（4）如图2所示，若用两种识别切割序列完全不同的限制酶E和F从基因组DNA上切下目的基因，并将之取代质粒pZHZ1(3.7kb，1kb=1000对碱基)上相应的E—F区域(0.2kb)。根据限制酶G和H单独切割重组质粒得到的两个片段之和均为4.7kb，说明目的基因的长度为4.7+0.2-3.7=1.2kb，已知在质粒pZHZl中，限制酶G切割位点距限制酶E切割位点0．8kb，限制酶H切割位点距限制酶F切割位点O．5kb，若分别用限制酶G和H酶切两份重组质粒pZHZ2样品，据表所列酶切结果可知，在重组质粒上含有两个限制酶G切割位点和两个限制酶H切割位点，说明插入的目的基因上分别含有一个限制酶G切割位点和一个限制酶H切割位点，根据单独使用限制酶G切割形成1.6kb和3.1kb两段，由于GE为0.8kb，说明距离E位点0.8kb的目的基因上有一个限制酶G切割位点，同理，根据单独使用限制酶H切割重组质粒形成1.2kb和3.5kb两段，由于FH为0.5kb，说明距离限制酶F切割位点的0.7kb的目的基因上有一个限制酶H切割位点（即距离质粒上H点1.2kb的目的基因上有限制酶H的切割位点），综上分析，目的基因上限制酶G切割位点和限制酶H切割位点之间的距离为0.3kb，故图示如下：。

Ⅱ．（1）根据1和2组实验结果可知，在没有M蛋白的情况下，荧光标记只存在于细胞内，而和正常M蛋白基因连接后，荧光标记出现在了培养液中，即正常M蛋白合成后会分泌到细胞外，但是和青光眼患者M蛋白基因连接后，细胞外将不会出现荧光标记，由此可见，发育型青光眼的病因是M蛋白基因异常导致其指导合成的M蛋白异常，导致小梁细胞中的M蛋白不能正常地分泌到细胞外而在细胞中大量积累，最终导致小梁细胞功能异常。

（2）显性遗传病的个体只要含有致病基因就患病，结合上一小题的分析可知，表中第4组、5组、6组组实验可以为“发育型青光眼是显性遗传病”这一结论提供重要证据。