[题目]水稻是世界上最重要的粮食作物之一.是全球约半数人口的主粮.然而水稻只有在磷营养充足的条件下才能保证高产.S基因是番茄线粒体中的磷转运蛋白基因.科研人员将S基因转入水稻体内.以期望获得低磷条件下的高产水稻.操作流程如下:(1)磷是构成等物质的重要组成元素.土壤溶液中的磷浓度一般不超过2×10-12 mol/L.而植物细� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

【题目】水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是全球约半数人口的主粮。然而水稻只有在磷营养充足的条件下才能保证高产。S基因是番茄线粒体中的磷转运蛋白基因，科研人员将S基因转入水稻体内，以期望获得低磷条件下的高产水稻。操作流程如下：

（1）磷是构成____等物质的重要组成元素。土壤溶液中的磷浓度一般不超过2×10-12 mol/L，而植物细胞内的磷浓度却大于10×10-4 mol/L，因此植物从土壤中吸收磷的方式是____。

（2）提取番茄细胞的总RNA经过____得到的cDNA，用限制酶处理后与载体结合并转入受体菌体内，建立番茄的_____，从中获取S基因。但此途径得到的S基因两端没有限制酶识别序列，利用____技术添加相应序列并扩增。已知Ti质粒转录方向为顺时针，相关酶切位点如下表。

通过测序已知S基因部分序列如下：

请补充扩增结束后，大多数DNA片段的碱基对序列____________ 。

（3）构建含S基因的表达载体时，通常用两种限制酶切割含S基因的DNA片段和Ti质粒，限制酶作用部位为____（填化学键名称）。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用____处理农杆菌，使得表达载体易于导入。为了使S基因能够正确表达，还应插入的元件是什么_________（请在下图中画出并标注元件名称）。

（4）将表达载体导入农杆菌以及农杆菌与水稻愈伤组织共培养时需要进行筛选，这两步骤的培养基中都需要加入____，以筛选出成功导入表达载体的农杆菌和水稻愈伤组织。

（5）GUS基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。经无色物质K处理愈伤组织并筛选出了呈现蓝色的组织，说明____。

（6）农杆菌Ti质粒上的____序列，可以从农杆菌中转移并随机插入到被侵染植物细胞的____中。随机挑选三个转基因株系甲、乙、丙进行阳性检测试验。分别提取每个样品的基因组，利用限制酶进行酶切电泳验证，结果如下图所示，

甲、乙、丙转基因植株中分别被转入了____个S基因。

（7）通过盆栽转基因株系，分别在低磷条件下和磷正常条件下测定____以验证转入S基因是否能达到目的。测定结果如下图。

结果显示____，从而说明低磷条件下，S基因可以调控转基因水稻对磷的吸收与积累，提高转基因水稻产量。

（8）本实验的研究价值在于____。

【答案】ATP、磷脂、核酸主动运输逆转录 cDNA文库（部分基因文库） PCR 磷酸二酯键 Ca2+ 氨苄青霉素 S基因在水稻细胞中已成功表达 T-DNA 染色体DNA 3、2、3 单株产量磷正常条件下单株产量与对照组相比，没有显著性差异；低磷条件下，三个转基因株系的单株产量均显著高于对照组充分挖掘植物自身高效吸收与利用磷素的磷转运蛋白，从根本上缓解低磷胁迫对包括水稻在内的作物影响，从而实现低投入、高产出、少污染的农业可持续发展具有重要的意义

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取：
（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。

2、基因表达载体的构建:
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
（3）基因表达载体的构建过程：

3、将目的基因导入受体细胞:
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用的转化方法：常用方法有农杆菌转化法、显微注射技术、Ca2+处理法。
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

4、目的基因的检测和表达：
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

（1）细胞中含磷的物质有核酸、ATP、磷脂；故磷是构成核酸、ATP、磷脂等物质的重要组成元素。细胞通过逆浓度梯度吸收磷，因此植物从土壤中吸收磷的方式是主动运输。

（2）RNA经过逆转录得到的cDNA，用限制酶处理后与载体结合并转入受体菌体内，建立番茄的cDNA文库（部分基因文库），从cDNA文库中获取目的基因S。S基因两端没有限制酶识别序列，通过PCR技术添加相应序列并扩增。已知Ti质粒转录方向为顺时针，通过图示中重组质粒分析，插入目的基因的左侧所用的限制性酶是BamHI，右侧所用的限制性酶是HindIII，再通过表格中限制性酶切割的具体碱基序列，结合S基因的碱基序列，可知扩增结束后，大多数DNA片段的碱基对序列：

。

（3）限制酶催化断裂的是磷酸二酯键。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于感受态。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子和终止子，启动子位于基因的首端，终止子位于基因的尾端：。

（4）重组质粒中有标记基因--氨苄青霉素抗性基因，故为了筛选出成功导入表达载体的农杆菌和水稻愈伤组织，培养基中都需要加入氨苄青霉素。

（5）图示中可以看出，重组质粒含GUS(β-葡糖苷酸酶)基因，GUS(β-葡糖苷酸酶)基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，根据这一特性。经无色物质K处理愈伤组织并筛选出了呈现蓝色的组织，说明S基因在水稻细胞中已成功表达。

（6）农杆菌Ti质粒上的T-DNA序列，可以从农杆菌中转移并随机插入到被侵染植物细胞的染色体DNA中。转基因株系甲、乙、丙进行阳性检测试验结果，通过实验结果看出，甲道出现3个条带，乙道出现2个条带，丙道出现3个条带，故甲、乙、丙转基因植株中分别被转入了3、2、3个S基因。

（7）通过柱形图的纵轴可知，通过盆栽转基因株系，分别在低磷条件下和磷正常条件下测定单株产量相对值以验证转入S基因是否能达到目的。测定结果显示磷正常条件下单株产量与对照组相比，没有显著性差异；低磷条件下，三个转基因株系的单株产量均显著高于对照组，从而说明低磷条件下，S基因可以调控转基因水稻对磷的吸收与积累，提高转基因水稻产量。

（8）本实验的研究价值在于充分挖掘植物自身高效吸收与利用磷素的磷转运蛋白，从根本上缓解低磷胁迫对包括水稻在内的作物影响，从而实现低投入、高产出、少污染的农业可持续发展具有重要的意义。

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