Question

11． Rag₂基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞．科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗．其技术流程如图：

（1）步骤①中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中（MⅡ中）期．
（2）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点．
（3）步骤③中，需要构建含有Rag₂基因的表达载体（重组质粒）．可以根据Rag₂基因的核苷酸序列设计合成引物，利用PCR技术扩增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag₂基因片段．为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点．
（4）为检测Rag₂基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质，用抗Rag₂蛋白的抗抗体进行抗原-抗体杂交．

Answer 1

分析 分析题图：图示是利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag₂基因缺失小鼠进行基因治疗的过程图解，其中①表示核移植过程，②表示早期胚胎培养过程，③表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞．

解答 解：（1）步骤①核移植中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中期．
（2）胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）．故步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点．
（3）步骤③中，需要构建含有Rag₂基因的表达载体；设计引物要遵循碱基互补配对原则，所以根据Rag₂基因的核苷酸序列进行设计；利用PCR技术可在体外大量扩增目的基因；Rag₂基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割获得的，所以表达载体应具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位点．
（4）基因表达的产物是蛋白质，所以提取小鼠骨髓细胞的蛋白质进行抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）减数第二次分裂中（MⅡ中）
（2）内细胞团    细胞体积小，细胞核大，核仁明显
（3）表达载体（重组质粒）    引物     PCR　  HindⅢ和PstⅠ
（4）抗原-抗体杂交

点评 本题结合图解，综合考查基因工程、细胞工程和胚胎工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题；识记核移植的具体过程；识记体外受精的具体过程及早期胚胎发育的过程，能结合所学的知识准确答题．