Question

【题目】科研工作者利用胚胎干细胞和基因敲除技术改造老鼠体内的特定靶基因，使实验鼠体内的靶基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能，这种技术的应用，使我们能够更深入地了解胚胎发育、老化以及疾病的过程。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段（部分序列与靶基因相同，从而使该片段特异性插入靶基因）使靶基因突变而达到基因敲除的目的。原理如图：

科研工作者获取稳定遗传的纯合体基因敲除小鼠一般经历下列过程：

（1）获取干细胞悬浮液

科学家将动物胚胎组织用_____________处理使其细胞离散 ，再通过CO2培养箱培养胚胎干细胞。CO2的作用是_________________；胚胎干细胞分化为不同组织器官的原因是 __________________________________。

（2）构建重组DNA分子

构建含有“同源性片段”的重组DNA分子时要用到的工具酶有________________；该实验病毒的作用是_____________。

（3）获取含重组基因的干细胞

基因转移的同源重组自然发生率极低（动物的重组概率为10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的标记基因作用非常重要，可采用__________________技术检测或利用选择培养基筛选。靶基因被插入同源性片段后发生基因突变，该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、化学诱发突变的______________特点，便于专一性研究靶基因的功能。

（4）将重组的胚胎干细胞通过显微注射技术导入胚泡（囊胚中），然后将胚泡植入受体小鼠子宫中，获取子代嵌合体小鼠。其中一些子代小鼠的配子不含无活性基因，原因可能是____________________（答出2点）。X代中含有无活性基因的雌鼠和雄鼠均为_________________。

（5）获取基因敲除纯合子小鼠

假设已获取1只雌性基因敲除杂合子小鼠。用遗传图解表示利用该鼠通过杂交实验获得纯合基因敲除小鼠的过程。（靶基因用A表示，插入同源片段的靶基因用A+表示 ）

________________________

Answer 1

【答案】 胰蛋白酶 调节pH 基因的选择性表达 限制性内切酶、DNA连接酶 载体 DNA分子杂交 随机性和不定向性 子代小鼠可能为杂合子； 重组胚胎干细胞未分化为精原细胞或卵原细胞 杂合子

【解析】试题分析：基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源DNA片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，由此可见，基因敲除可定向改变生物体的某一基因，基因敲除既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因，因此利用基因敲除技术可以修复细胞中的病变基因来治疗基因遗传病，但不能治疗染色体异常遗传病。

（1）动物细胞培养时，应用胰蛋白酶处理胚胎组织使其分散成单个细胞，动物细胞培养时的气体环境是95%的空气+5%二氧化碳的混合气体，CO2起到调节 PH值作用。胚胎干细胞具有分裂和分化能力，能分化成不同组织器官，原因是基因的选择性表达。

（2）构建同源性片段的重组DNA分子时，先要使用限制性内切酶对供体基因和运载体进行切割，然后再使用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子，在使用病毒将重组DNA分子运入到受体细胞，因此该病毒的作用是载体。

（3）标记基因的作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因，检测 受体细胞中的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。靶基因被插入同源性片段后发生基因突变，该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、化学诱发突变的随机性和不定向性特点，便于专一性研究靶基因的功能。

（4）重组的胚胎干细胞通过显微注射技术导入胚泡，获取子代嵌合体小鼠，一些子代小鼠的配子不含无活性基因，原因可能是子代小鼠可能为杂合子或重组胚胎干细胞未分化为精原细胞或卵原细胞，由于正常小鼠中不含有同源片段的靶基因，因此X代中含有无活性基因的雌鼠和雄鼠均为杂合子。

（5）雌性基因敲除杂合子小鼠基因型为AA+，可利用该鼠与基因型为AA的雄鼠杂交，获得子一代基因型为AA+雌雄小鼠再交配，可获得基因敲除纯合子小鼠（即A+A+）。遗传图如下：