Question

【题目】科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对于扰素基因缺失小鼠进行基因治疗，其技术流程如图1：

(1)步骤①中，在核移植前应去除卵母细胞的______________________，常用的导入目的基因的方法为______________________。

(2)将基因导入ES细胞而不是导入到上皮细胞是因为______________________。

(3)步骤③中，需要构建含有干扰素基因的______________________。已知DNA分子复制过程中，子链延伸的方向是从5′端→3′端，构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______________________作为引物。对干扰素基因片段和质粒进行酶切时，可选用限制酶的组合为______________________。

(4)将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发___________色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用______________________的方法。

Answer 1

【答案】细胞核 显微注射法 ES细胞具有发育的全能性（或经诱导可发育为各种组织、器官或细胞） 基因表达载体 B和C Hind Ⅲ和Pst Ⅰ（或EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ） 绿 抗原——抗体杂交

【解析】

本题以基因治疗的流程图为载体，考查了基因工程、细胞工程以及胚胎工程等方面的知识，难度适中。考生要能够识记细胞核移植的过程；识记囊胚包括内细胞团和滋养层两部分；明确基因工程中质粒和目的基因需要利用同种限制酶进行切割；掌握目的基因检测和鉴定的一般方法等。

分析图1：图示是利用胚胎干细胞（ES细胞）对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的流程，其中①表示通过核移植技术获得重组胚胎的过程；②表示早期胚胎培养过程；③表示采用基因工程技术将目的基因导入受体细胞的过程。

分析图2：该DNA片段含有四种限制酶识别序列和切割位点，其中SamⅠ酶的识别序列和切割位点位于目的基因上。

分析图3：图3为质粒结构示意图，该质粒含有2个标记基因（红色荧光标记基因和绿色荧光标记基因）。

(1)①表示通过核移植技术获得重组胚胎的过程；核移植前要先用显微操作的方法去除卵母细胞的细胞核，并将第一极体也一并除去；导入目的基因进入动物细胞常用显微注射法。

(2)从囊胚的内细胞团中分离出来的ES细胞具有发育的全能性，可发育为各种组织、器官或细胞，所以将基因导入ES细胞。

（3）步骤③是将目的基因导入ES细胞，该过程之前需要构建基因表达载体；DNA复制只能从5’到3’，因此构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C作为引物。由图可知，SamⅠ酶的识别序列和切割位点位于目的基因上，用该酶切割会破坏目的基因，因此对干扰素基因片段和质粒进行酶切时，可选用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ。
（4）用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ切割时会破坏红色荧光蛋白基因，但不会破坏绿色荧光蛋白基因，因此将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发绿色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用抗原-抗体杂交法检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质。