Question

【题目】现代基因编辑CRISP／Cas9技术可以对生物的DNA序列进行定点切割。将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为外源基因构建基因表达载体后，导入受体细胞，可将细胞内某个基因定向敲除，其作用机理如下图所示。请回答问题。

（1）sgRNA与Cas9酶是一个功能复合体。如图所示，sgRNA有引导作用，与A基因中部分序列碱基互补配对，Cas9酶在配对区域定点切割，导致A基因发生碱基对_________，基因丧失功能。sgRNA与Cas9酶的联合作用类似于_________酶的作用。如果要获得基因敲除动物个体，应以_________作为受体细胞，用_________法导入CRISP／Cas9基因表达载体。

（2）研究人员担心基因编辑发生“脱靶效应”，导致其他非目标基因发生突变，我国科学家对此进行了检测。在小鼠受精卵分裂为两个细胞时，向其中一个细胞注入基因编辑工具，之后将此胚胎移植入母鼠子宫，待其发育到14.5天时，将胚胎取出，把胚胎的细胞全部分散开，分成基因编辑细胞后代和非基因编辑细胞后代两个细胞群，分别提取DNA，测序、比对。结果发现CRISP／Cas9技术的脱靶率很低，而另一类单碱基突变系统的基因编辑技术脱靶率极高。

①用同一受精卵分裂形成的两个细胞作为处理对象和对照，优点是________。

②利用二细胞胚胎分裂产生的子细胞DNA作为测序对象，而不是将实验组细胞和对照组细胞DNA进行PCR扩增后测序，原因是____________________________________。

③为方便将基因编辑细胞后代和非基因编辑细胞后代分开，可在构建基因表达载体时_____________________________________________。

④将胚胎细胞分散开需要利用_________酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因编辑技术之外，还利用了多项胚胎工程技术，请写出其中两项技术名称__________________。

（3）基因编辑的“脱靶效应”可能对被编辑个体带来什么不良影响?__________________

Answer 1

【答案】缺失 限制酶 受精卵 显微注射 这两个细胞的基因序列相同，避免因实验组和对照组细胞原有的基因序列差异掩盖“脱靶效应” PCR扩增会产生较多的复制错误，掩盖“脱靶效应”； 利用某种荧光蛋白基因作为标记基因 胰蛋白酶 体外受精技术、胚胎培养技术、胚胎移植技术 如果脱靶效应发生在原癌基因，可能导致细胞癌变

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）sgRNA与Cas9酶是一个功能复合体。如图所示，sgRNA有引导作用，与A基因中部分序列碱基互补配对，Cas9酶在配对区域定点切割，导致A基因发生碱基对 缺失，基因丧失功能。sgRNA与Cas9酶的联合作用类似于限制酶的作用。如果要获得基因敲除动物个体，应以受精卵作为受体细胞，用显微注射法导入CRISP／Cas9基因表达载体。

（2）①用同一受精卵分裂形成的两个细胞怍为处理对象和对照，优点是这两个细胞的基因序列相同，避免因实验组和对照组细胞原有的基因序列差异掩盖“脱靶效应” 。

②利用二细胞胚胎分裂产生的子细胞DNA作为测序对象，而不是将实验组细胞和对照组细胞DNA进行PCR扩增后测序，原因是PCR扩增会产生较多的复制错误，掩盖“脱靶效应”。

③为方便将基因编辑细胞后代和非基因编辑细胞后代分开，可在构建基因表达载体时利用某种荧光蛋白基因作为标记基因。

④将胚胎细胞分散开需要利用胰蛋白酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因编辑技术之外，还利用了多项胚胎工程技术，如体外受精技术、胚胎培养技术、胚胎移植技术。

（3）基因编辑的“脱靶效应”可能对被编辑个体带来的不良影响是如果脱靶效应发生在原癌基因，可能导致细胞癌变。