Question

【题目】下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒，导入大肠杆菌体内，目的是_________________________________。

（3）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（4）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（5）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（6）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

Answer 1

【答案】 SnaBⅠ、AvrⅡ 利用大肠杆菌无性繁殖速度快，短时间内可获取大量的重组质粒 DNA分子杂交 甲醇 加工（修饰） GATGCGTTCG

【解析】【试题分析】

本题结合工程菌形成过程，考查基因工程的相关知识，意在考查考生分析题图获取有效信息的能力，以及理解所学知识要点，把握知识间联系的能力。考生可根据题图和题干的提示、要求，梳理相关知识点，对各小题进行分析作答。

（1）图中质粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI4种限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ（识别的序列在启动子与终止子之间）切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaB、AvrⅡ限制酶识别序列；这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。

（2）用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒，导入大肠杆菌体内，其目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度快，短时间内可获取大量的重组质粒。

（3）检测目的基因是否成功插入到受体细胞染色体，通常用DNA分子杂交技术。

（4）分析资料1可知，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时诱导HBsAg基因表达。

（5）酵母菌为真核生物，具有内质网和高尔基体等细胞器，能够对蛋白质进行加工（修饰）为分泌蛋白，便于提取。而细菌等原核生物没有各种细胞器（除了核糖体）。

（6）图1的碱基排列顺序是GGTTATGCGT，说明从下向上观察，A是左边第一个，C是从左向右第二个，G是从左向右第三个，T是从左向右第四个，因此图2显示的碱基排列顺序是GATGCGTTCG。