Question

11．下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题．
资料1　巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5'AOX1和3'AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]．
资料2　巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，可以将目的基因整合于染色体中以实现表达．

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化．
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用DNA连接酶将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒．
（3）步骤3中应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞．
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子杂交方法进行检测．
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达．
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行加工（修饰）并分泌到细胞外，便于提取．

Answer 1

分析 分析题图：图中质粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上．要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割质粒，要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培养基中加入卡那霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌．

解答 解：（1）重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种内切酶对质粒和目的基因同时切割，便会各自出现相同的粘性末端，便于重组与表达，同时防止自身环化，因此在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的识别序列．
（2）①用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒；②导入大肠杆菌体内，目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度，短时间内可获取大量的重组质粒．
（3）重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其它限制酶会破坏含有启动子、终止子的目的基因．
（4）用DNA分子杂交技术检测是否导入目的基因．
（5）资料1显示，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时诱导HBsAg基因表达．
（6）酵母菌为真核生物，细胞内具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生物，不具有内质网和高尔基体等细胞器．
故答案为：
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA连接酶    大量重组质粒（重组质粒不得分）    
（3）BglⅡ
（4）DNA分子杂交    
（5）甲醇       
（6）加工（修饰）

点评 本题结合将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图，考查基因工程的原理及技术，要求考生识记基因工程的原理、工具及操作步骤，能结合题干和图中信息答题，有一定难度．