Question

6．多聚半乳糖醛酸酶PG能降解果胶使细胞壁破损，成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜．利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期．科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图．据图回答下列问题：

（1）若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．
（2）构建基因表达载体时，用限制酶切割DNA后可能产生黏性末端，也可能产生平末端，后者需用T₄DNA连接酶（E．coli DNA连接酶、T₄DNA连接酶）将双链DNA片段“缝合”起来．“缝合”的过程，就是恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的过程．
（3）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选．
（4）将转入反向链接PG基因的番茄细胞培育成完整的植株，需要用植物组织培养技术；其中，愈伤组织经再分化形成完整植株．
（5）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，培养24～48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，通过观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．

Answer 1

分析 分析题图：图示是将将PG基因反向接到Ti质粒上，导入到番茄细胞中，得到转基因番茄的过程．反义RNA一般是指与编码链或有义链互补的DNA链编码的RNA，mRNA是由编码链或有义链编码的RNA，所以反义RNA和mRNA分子能互补结合呈双链RNA．由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合抑制了翻译过程．

解答 解：（1）若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．
（2）构建基因表达载体时，用限制酶切割DNA后可能产生黏性末端，也可能产生平末端；平末端需用T₄DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来．“缝合”的过程，就是恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的过程．
（3）由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选．
（4）将转基因番茄细胞培育成完整的植株还需要采用植物组织培养技术；该技术包括脱分化和再分化两个步骤，其中愈伤组织经再分化形成完整植株．
（5）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，培养24～48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，通过观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．
故答案为：
（1）逆转录法
（2）平末端    T₄DNA连接酶    磷酸二酯键
（3）卡那霉素
（4）植物组织培养   再分化（或细胞增殖与分化）
（5）质壁分离

点评 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，掌握各步骤的相关细节；识记植物组织培养的过程，能结合所学的知识准确答题．