Question

【题目】细胞内具有多种miRNA对基因表达有重要的调节作用，研究人员利用基因编辑技术建立miRNA-301a（某种miRNA）基因敲除的小鼠模型，用于研究miRNA-301a的调节功能。请回答相关问题：

（1）下图为miRNA形成和发挥作用的过程简图，据图可知miRNA基因通过___________形成前体miRNA，然后经过________过程形成miRNA，miRNA通过________调控翻译过程。

（2）构建miRNA基因敲除的小鼠。其作用机制如下图所示。

注：gRNA与Cas9蛋白结合后可以切割DNA

①取miRNA基因：根据miRNA基因序列设计并合成______________________，然后通过_________技术扩增得到miRNA基因。同理构建gRNA的模板DNA。

②构建基因表达载体：利用________________________酶构建如下图所示的基因表达载体。

③通过体外转录获得miRNA-gRNA，再将miRNA-gRNA与Cas9混合后采用显微注射技术注入小鼠__________________中。

（3）经上述操作获得的8只小鼠称为F0代。

①经过限制酶Ⅰ剪切后电泳检测小鼠miRNA基因敲除情况如下图所示。

F0代小鼠检测其中5号为野生型，M为标准物）F0代中_____________号为基因敲除小鼠，经过基因测序后选择_____________与敲除碱基对数目最多的4号小鼠杂交，产生F1代小鼠。

②用限制酶Ⅱ剪切后电泳检测F1代小鼠如图1所示。

从F1中选出4号和5号个体杂交产生F2代小鼠，然后用同种方法检测F2代小鼠结果如上图2所示，最终确定F2代中________号小鼠为miRNA基因敲除纯合子小鼠。

Answer 1

【答案】转录 剪切、酶切、解旋（剪切、酶切过程必须有） 与mRNA结合阻止核糖体移动 引物 PCR 限制酶和DNA连接酶 受精卵 1234678号 野生型（或5号） Ⅱ-1号和Ⅱ-5号

【解析】

1、转录过程以四种核糖核苷酸为原料，以DNA分子的一条链为模板，在DNA解旋酶、RNA聚合酶的作用下消耗能量，合成RNA。

2、翻译过程以氨基酸为原料，以转录过程产生的mRNA为模板，在酶的作用下，消耗能量产生多肽链，多肽链经过折叠加工后形成具有特定功能的蛋白质。

3、基因工程的操作步骤：目的基因的获取（基因文库获取、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平—DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平—抗虫、抗病接种实验等）。

(1)根据miRNA形成和发挥作用的过程图可知,miRNA基因首先通过转录形成前体miRNA,前体rniRNA接着经过剪切、酶切、解旋过程形成成熟的miRNA;miRNA和蛋白质结合后,形成miRNA -蛋白复合物,该复合物通过与mRNA结合后阻止核糖体在mRNA.上的移动，阻止了翻译过程的继续进行。

(2)构建miRNA基因敲除的小鼠要经历3个步骤。

①获取miRNA基因:根据miRNA基因序列设计并合成引物,然后通过PCR技术扩增得到miRNA基因。同埋构建gRNA的模板DNA。

②构建基因表达载体:利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶这两种工具酶构建基因表达载体,获得同时含有miRNA和gRNA的基因片段。

③通过获得的含有miRNA和gRNA的基因片段,在体外转录获得miRNA-gRNA(一种mRNA;再将miRNA-gRNA与Cas9蛋白混合后,采用显微注射技术注人小鼠受精卵中。miRNA-gRNA中的miRNA就可以通过碱基互补配对和DNA中的miRNA基因结合起来,将gRNA和Cas9蛋白定向地引导到miRNA基因所在的位置，gRNA和Cas9蛋白将miRNA基因从一个DNA上切除,这样受精卵就出现了缺乏miRNA基因的DNA,受精卵发育形成的小鼠体细胞中也会出现不含有miRNA基因的DNA。

(3)①由于小鼠体细胞的同源染色体成对存在,因此同源染色体上的DNA也是成对存在的。5号野生型小鼠染色体上的两个含有miRNA基因的DNA都是正常的，基因型假设为AA,经过限制酶I剪切后，只产生750 bp的DNA片 段。缺乏miRNA基因的一个DNA被酶切割后，产生的是500 bp的片段。因此,F0中1、2、3、4、6、7、8号均为基因敲除小鼠;经过基因测序后选择野生型(5号)与敵除碱基对数目最多的4号小鼠杂交产生F小鼠。

②用限制酶II剪切后电泳检测Ft小鼠,4号和5号个体都含有750 bp和500 bp的片段。它们杂交后产生F2小鼠, II1号和II5号只含有500 bp的片段,它们只含有缺乏miRNA的DNA,是miRNA基因敲除的纯合子。