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    3．图甲表示某细菌的质粒中相关限制酶的切割位点，图乙表示目的基因所在的DNA中相关限制酶的切割位点．请分析并回答下列问题：

    （1）用Sma l限制酶处理图甲所示的质粒会得到2个DNA片段，用AluⅠ处理图乙所示的外源DNA会增加2个游离的磷酸基团．
    （2）为了避免目的基因和质粒在酶切后产生的片段发生自身环化或任意连接，以及便于筛选需要，在实际操作中，一般应选用PstI和HindⅢ（填限制酶名称）同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA．再用DNA连接酶处理．如果是用PCR技术扩增目的基因，设计引物是关键，但在扩增时退火温度一般为55℃一60℃，对于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%时一般用60℃，原因是G与C（之间是三个氢键）比例越高越稳定[或A与T（之间是二个氢键）比例越高越不稳定]．
    （3）为了筛选获得含有重组质粒的大肠杆菌，实验人员首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含四环素（抗生素）的培养基中，然后用影印法将该培养基上的菌落按原来的方向印在含氯霉素（抗生素）培养基上，以筛选获得含重组质粒的细菌．在含四环素培养基中能生长繁殖，而在含氯霉素培养基中不能生长繁殖的是导人了重组质粒（或目的基因）的大肠杆菌．

    （4）经检测：在上述导入了重组质粒的大肠杆菌菌株中，目的基因正常转录形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性，最可能的原因是大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体（或大肠杆菌缺乏生物膜系统），不能对多肽链进行加工（折叠、组装与修饰）．

    分析 分析题图：外源DNA含有四个酶切位点，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位点位于目的基因上，所以不能用此酶切割；质粒也含有SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶的酶切位点，但用SmaⅠ酶切割会将质粒上两个标记基因均破坏，所以不能用SmaⅠ酶切割；所以构建基因表达载体时，应选用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA．用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒，会破坏氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，但不能抗癌变青霉素．

    解答 解：（1）质粒上含有两个SmaⅠ限制酶的切割位点，所以用SmaⅠ限制酶处理图甲所示的质粒会得到2个DNA片段；图乙所示的外源DNA含有一个AluⅠ限制酶的切割位点，所以用AluⅠ处理外源DNA会形成两个黏性末端，增加2个游离的磷酸基团．
    （2）外源DNA含有四个酶切位点，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位点位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割会将质粒上两个标记基因均破坏，所以不能用SmaⅠ酶切割；应选用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA，这样可以避免目的基因和质粒在酶切后产生的片段发生自身环化或任意连接，也便于筛选需要．如果是用PCR技术扩增目的基因，设计引物是关键，但在扩增时退火温度一般为55～60℃，对于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%时一般用60℃，原因是G与C之间是三个氢键，所以C和G比例越高，DNA越稳定．
    （3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒，会破坏氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，但不能抗癌变青霉素．为了筛选获得含有重组质粒的大肠杆菌，首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含四环素的培养基中，然后用影印法将该培养基上的菌落按原来的方向印在含氯霉素培养基上，以筛选获得含重组质粒的细菌．在含四环素培养基中能生长繁殖，而在含氯霉素培养基中不能生长繁殖的是导入了重组质粒的大肠杆菌．
    （4）因为大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体，不能对多肽链进行折叠、组装与修饰，所以在上述导入了重组质粒的大肠杆菌菌株中，目的基因正常转录形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性．
    故答案为：
    （1）2   2
    （2）PstI和HindⅢG与C（之间是三个氢键）比例越高越稳定[或A与T（之间是二个氢键）比例越高越不稳定]
    （3）四环素    氯霉素     重组质粒（或目的基因）
    （4）大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体（或大肠杆菌缺乏生物膜系统），不能对多肽链进行加工（折叠、组装与修饰）

    点评 本题以图为载体，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤及相关细节，掌握基因工程技术的相关应用，能结合图中信息准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查．

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