Question

【题目】金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。

（2）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（3）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。

（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。

Answer 1

【答案】 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 GC含量高 ②③

【解析】试题分析：图中代表PCR技术流程，步骤1代表模板DNA在94℃的高温下变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（1）引物的作用是作为DNA复制的起点，由于目的基因前端插入了引物，所以在构建重组质粒时，要在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的酶切位点，保证目的基因完整地插入到重组质粒中；设计引物时要注意避免引物之间碱基互补配对，形成环状DNA，使其无法插入重组质粒中。

（2）步骤1所示模板DNA在94℃的高温下变性，使DNA断开双链结构。

（3）PCR的退火过程中，进行的是引物与模板链的结合，如果温度过高，会破坏引物与模板链之间的碱基配对；由于碱基之间是以氢键连接的，碱基A与T之间以两个氢键连接，碱基C与G之间以三个氢键连接，相比之下C与G之间稳定性更高，所以长度相同但碱基G与C含量高的引物需要设定更高的退火温度。

（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则说明退火过程出现问题，由于退火温度过高导致引物与模板链无法结合，或是由于引物设计的不合理，使其无法和模板链互补结合。