Question

4．已知图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，且限制酶的切点是唯一 的，外源DNA插入会导致#应的基因失活．请回答有关基因工程操作的问题：

（1）图1表示的是1个经过人工改造的作为载体的质粒．作为基因表达载体除图1所示结构外，还需具有目的基因和终止子．
（2）根据图中所给信息，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是BclI和HindⅢ．若将基因表达载体导入大肠杆菌，一般先用钙离子处理，使其成为感受态细胞，以利于吸收周围环境中的DNA分子，然后调控温度完成转化过程．
（3）为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，应在培养基中添加四环素；培养一段时间后，平板上长出菌落．用PCR技术鉴定时，所用的引物是图2中引物甲和引物丙．PCR技术扩增目的基因，每一循环包括变性、复性（退火）、延伸三步．

Answer 1

分析 基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

解答 解：（1）图1为质粒，天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的．基因表达载体的组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等，图中已经有启动子和标记基因（四环素抗性基因），还缺少目的基因和终止子．
（2）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclI和HindⅢ两种限制酶切割．将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用Ca²⁺处理，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，然后让基因表达载体在缓冲液中与该细胞混合，调控温度完成转化过程．
（3）由图可知，标记基因是四环素抗性基因，因此要筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中添加四环素．PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙．PCR技术扩增目的基因，每一循环包括变性、复性、延伸三步．
故答案为：
（1）人工改造           目的基因和终止子
（2）BclI和HindⅢ吸收周围环境中的DNA分子
（3）四环素       引物甲和引物丙     复性（退火）     延伸

点评 本题结合基因结构图和运载体结构图，考查基因工程的技术和原理，重点是限制酶和DNA连接酶，要求考生认真分析图1和图2，能根据图中和表中信息选择合适的限制酶，准确判断使用DNA连接酶连接的结果，再运用所学的知识答题．